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NCAPG está regulado en NSCLC

Para identificar nuevos objetivos terapéuticos del NSCLC, realizamos secuenciación de transcripciones en tres muestras de tejido tumor pareado ensambladas y tejidos normales adyacentes. Identificamos 415 genes desregulados y 158 genes desregulados (Fig. manzananbsp;1A, log2FC &gt; 1 o &gt; 1, href="/articles/10.1186/s #Fig1" &gt; 1B, C). Sorprendentemente, 13 genes participaron simultáneamente en estos cuatro procesos biológicos (Fig. 1C). Además, el análisis de datos de TCGA mostró que los 13 genes fueron sobreexprimidos en tejidos tumorales de NSCLC (Fig. 1D, log2FC √≥ 2, p < Se redujo significativamente significativamente significativamente el NCAPG con la supervivencia del paciente de NSCLC (Fig. 1E, Fig. S1, n= 500, casos de alta expresión = 250, casos de baja expresión = 250, p= 0.001). De conformidad con los resultados de análisis de datos TCGA (Fig. 1F), el análisis de datos GEO también mostró que NCAPG se expresó altamente en los tejidos tumorales NSCLC (Fig. 1G, p se hizo referencia conveniente0.001). Además, la expresión NCAPG se correlacionó significativamente con la etapa TNM (n= 970, p 0) correspondió significativamente con la etapa T (n= 970, p ) fue significativamente correlacionada con la etapa TNM (n= 970, p ), y la etapa N (n= 970, p ¬) (n= 970, p ). Los resultados anteriores sugieren que la expresión NCAPG está positivamente relacionada con NSCLC.


Fig. 1 Identificación de la expresión NCAPG en NSCLC. Un diagramas de volcanes secuenciados genéticamente de tejidos tumorales NSCLC y tejidos normales adyacentes (azul indica genes desregulados; rojo indica genes regulados). B Análisis GO-BP de genes regulados en tejidos tumorales. C Heatmaps de los 39 genes regulados involucrados en ciclo celular, división mitótica, división celular y ciclo celular mitótico. D Los 13 genes regulados altamente expresados en tejidos tumorales NSCLC de la base de datos TCGA. E La relación entre la expresión y supervivencia del NCAPG en NSCLC de la base de datos TCGA. F, G NCAPG nivel de expresión en las bases de datos TCGA y GEO. (*** p = 0,001)


Cuadro 1 Etapa NSCLC y su correlación con la expresión NCAPG en la base de datos TCGA


Para investigar más a fondo la expresión y el valor pronóstico del NCAPG, se realizó el IHC para evaluar la expresión NCAPG en los tejidos tumorales del NSCLC (Fig. manzananbsp;2A). Nuestro estudio demostró que el nivel de expresión del NCAPG estaba correlacionado con género, edad y tipo histopatológico (tabla 2). Kaplan-Meier survival analysis showed that NCAPG expression was negatively correlated with survival in NSCLC patients (Fig. 2B, n = 156, p= 0.003), particularly in elderly patients (≥ 60 years old) (Fig. 2C, n = 84, p= 0.0022), adenocarcinoma (Fig. 2D, n = 92, p= 0.0239), and squamous cell carcinoma El análisis de regresión de los coxs demostró además que la expresión NCAPG era un factor de riesgo independiente para la supervivencia del paciente del NSCLC (Table implicanbsp;3, p= 0.022). Importantly, both RT-qPCR and Western blot analyses showed that NCAPG expression was significantly increased in tumor tissues when compared with adjacent normal tissues (Fig. 2F, G). Además, el NCAPG fue especialmente sobreexpresado en seis líneas celulares del NSCLC, con la máxima expresión en las células A549 (Fig. 2H, I).


Fig. 2 Sobreexpresión de NCAPG en tejidos NSCLC y líneas celulares. Una expresión NCAPG en tejidos tumorales NSCLC por IHC. Izquierda: negativa; media derecha: positiva; arriba: adenocarcinoma; fondo: carcinoma de células escamosas. B La relación entre la expresión y supervivencia del NCAPG en pacientes del NSCLC. C-E Esta correlación negativa entre la expresión y supervivencia del NCAPG se identificó en pacientes mayores (≥ 60 años) (n= 84, p= 0.0022), adenocarcinoma (n= 92, p= 0.0239) y carcinoma de células escamosas (n= 43, p= 0.0296). F, G NCAPG mRNA (F) y expresión de proteínas (G) en tejidos tumorales NSCLC (n=21) (T: tejidos tumorales, N: tejidos normales adyacentes emparejados). H, I NCAPG mRNA (N: Promedio NCAPG mRNA expresión en tejidos normales adyacentes (n= 21) y proteínas (N: Nivel de proteína representativo de NCAPG en tejidos normales adyacentes) expresión en las líneas celulares NSCLC


Cuadro 2 Características de los pacientes y su asociación con la expresión NCAPG


Cuadro 3 Datos resumidos para el análisis de regresión de los riesgos proporcionales de Cox sobre el efecto de las características clínicopatológicas y la expresión NCAPG sobre la supervivencia general


El agotamiento del NCAPG inhibe la proliferación, la migración y la invasión de las células del NSCLC

Las células A549 transfectadas con un shRNA de control o shRNAs específicamente contra NCAPG fueron detectadas por el bloque occidental, y el inhibidor de NCAPG shRNA3 fue el inhibidor más eficaz de NCAPG y fue elegido para tratar las células NSCLC (Fig. Tanto el MRNA como los niveles de expresión de proteínas de NCAPG se disminuyeron significativamente después de la caída del NCAPG en A549 (Fig. 3B, p < 0.001) href="/articles/10.1186/s #Fig2" Clave2S E, F, p < Se llevó consigo mismos.0.05). Además, la caída del NCAPG inhibió significativamente la proliferación celular, la migración y la invasión (Fig. 3C-E, p <ecto correspondían implicanbsp;0.001; Fig. 2S G-I, p <елеющnbsp;0.0001). Además, también hemos utilizado shRNA2 para transfectar las células NSCLC, y hemos logrado resultados similares que NCAPG derribar inhibió la proliferación celular, la migración y la invasión (no se muestra la información).


Fig. 3 Los efectos de NCAPG noquedad in vitro e in vivo. A, B Se analizó la disminución de mRNA y la expresión de proteínas de NCAPG en las células A549 después de la caída de NCAPG utilizando RT-qPCR y blot occidental. C-E Las capacidades inhibidas de la proliferación (C), la migración (D) y la invasión (E) de las células A549 después de la caída del NCAPG se mostraron. Los tumores se disecaron de axila subcutánea de ratones inyectados con células H1299 de LV-shNCAPG y células H1299 de LV-shCtrl, y la expresión de NCAPG, SPARC y Ki-67 de tumores fue probada utilizando inmunohistoquímica. G, H Tumor volumes (G) and tumor weights (H) of xenografts in LV-shNCAPG and LV-shCtrl group. I La fotografía de tumores pulmonares formados por inyección de células LV-shNCAPG o LV-shCtrl H1299 en vena caudal. J El número de tumores pulmonares metastásicos en el grupo LV-shNCAPG y LV-shCtrl


Para explorar si el NCAPG podría influir en el crecimiento tumoral del NSCLC in vivo, realizamos experimentos xenograft en ratones nudos BALB/c por inyección subcutánea de células H1299 transfectadas con LV-shNCAPG o LV-shCtrl. La inmunohistoquímica de los tejidos tumorales xenograft mostró que la expresión Ki-67 se redujo en los tumores LV-shNCAPG (Fig. 3F). Estos resultados mostraron que la reducción de NCAPG reprimió significativamente el crecimiento tumoral, y que el volumen y el peso de los xenografts LV-shNCAPG fueron notablemente disminuidos en comparación con el de los tumores LV-shCtrl (Fig. 3F-H, p < se indicaron conveniente0.01). Estos datos fueron confirmados de forma independiente mediante xenografts A549 transfectados con plasmid LV-shNCAPG (Fig. S2 A-D, p <י correspondió a tercerosnbsp;0.05).


Además, el SPARC, una proteína que regula la señalización epitelial-mesenquimal-paracrina [17], también fue reprimida significativamente (Fig. 3F). Sospechamos que el NCAPG podría desempeñar un papel en la metástasis tumoral. Para evaluar la relación entre la metástasis tumoral NCAPG y NSCLC in vivo, establecimos un modelo tumoral de metástasis pulmonar en ratones diabéticos/severos de la nariz (NOD/SCID) y observamos que silenciando NCAPG en células H1299 metástasis pulmonares suprimidas (Fig. 3I, J), indicando que la capacidad de metástasis del tumor se inhibe significativamente inhibe después del NCAPG Sin embargo, si el NCAPG promueve la metástasis tumoral del NSCLC a través del SPARC debe estudiarse más a fondo.


La deficiencia de Ncapg suprime el cáncer de pulmón inducido por uretano in vivo

Para seguir investigando el papel de Ncapg en el cáncer de pulmón inducido por uretano, se administró uretano a ratones deficientes de Ncapg. Generamos construcciones de nocautación de genes Ncapg y cruzamos ratones heterocigoos dirigidos para generar ratones Ncapg−/. Debido a la letalidad embrionaria después de la caída de Ncapg (Fig. S3 A, B), sólo se pueden detectar ratones Ncapg+/ y Ncapg+/+ usando electroforesis de gel de PCR y agarose para probar los fibroblastos embrionarios del ratón (MEF) en el día embrionario 9 (Fig. S3 C, D). Ha establecido que la exposición repetida de uretano resulta en el adenoma pulmonar y la formación de adenocarcinoma [18]. Por lo tanto, los ratones Ncapg+−/ y de tipo ancho C57BL/6 fueron inyectados intraperitonealmente con uretano para inducir tumor pulmonar (Fig. limitnbsp;4A). Confirmamos que la expresión de MRNA de NCAPG en órganos de Ncapg+/− ratón fue atenuada (Fig. 4B). Los resultados indicaron que el número de nódulos tumorales formados en los tejidos pulmonares Ncapg+/− fue significativamente menor que el del grupo de tipo ancha (Fig. 4C-E). Estos datos indican que el NCAPG desempeña un papel significativo en la tumorigenesis pulmonar.


Fig. 4 tumor pulmonar inducido por uretano en ratones Ncapg+/+ y Ncapg+/−. A La estrategia del tumor pulmonar espontáneo inducida por uretano. B NCAPG mRNA análisis de expresión de los órganos principales en Ncapg+/+ y Ncapg+/− ratones. C La fotografía del tumor pulmonar inducido por uretano e imágenes representativas de la tinción de hematoxilina-eosina en Ncapg+/+ y Ncapg+/− ratones. D, E Número (D) y Volumen (E) de los tumores pulmonares inducidos por uretano en Ncapg+/+ y Ncapg+/−mice. (* p 0,105)


LGALS1 interactúa con NCAPG para mediar la progresión tumoral en células NSCLC

Para dilucidar el mecanismo por el cual NCAPG promueve la proliferación celular, la migración y la invasión en NSCLC, precipitamos y analizamos proteínas de intervención NCAPG en las células A549 usando Co-Immunoprecipitation (Co-IP) y Clorotografía-Mass Spectrometry (LC-MS), respectivamente (Fig. Las redes de proteínas de interacción con NCAPG fueron anotadas sobre la base de su correlación con las funciones de replicación, recombinación, reparación y metabolismo del ADN. LGALS1 (Galectin-1), una lectina de mamíferos ligados a β-galactoside, está sobreexpresada en NSCLC y está asociada con la progresión del cáncer y los trastornos inmunitarios. Utilizamos análisis de bases de datos INGENUITY® y análisis funcional de enriquecimiento para identificar que LGALS1 fue coprecipitado con NCAPG en células A549 (Fig. 5B, C). Además, detectamos una clara señal positiva que muestra la interacción de NCAPG y LGALS1 en células A549 por PLA junto con ensayos de inmunofluorescencia (Fig. 5D, E) y citómetro de flujo (Fig. 5F). Asimismo, el efecto de la caída de LGALS1 también inhibe la proliferación celular, la migración y la invasión en las células A549 y H1299 (Fig. 5G-M).


La Fig. 5 LGALS1 fue identificada como una importante proteína de intervención de NCAPG. A La imagen SDS-PAGE con Coomassie Blue Staining antes de la espectrometría de masas identificó proteínas de interacción NCAPG en las células A549. B La puntuación más alta de la red de proteínas de intervención de NCAPG se midió con análisis de enriquecimiento de funciones biológicas. C LGALS1 fue co-precipitado por NCAPG en células A549. D Para cada panel, las imágenes de izquierda a derecha mostraron señal PLA en las células A549 (rojo), núcleos celulares manchados por DAPI (azul), y sobreimpresiones de las dos imágenes. Barra de escala 20 μm. E El histograma muestra el valor fluorescente relativo de los puntuados y núcleos de PLA. F PLA señal de las células A549 para diferentes condiciones por el citometro de flujo. G Western blot analysis for LGALS1 protein after LGALS1 knockdown in A549 cells. H-M Las capacidades de proliferación, migración e invasión se disminuyeron después de que LGALS1-knockdown en células H1299 y A549. Barra de escala 50 μm. (**, numeranbsp;p); 0,01, terceronbsp;***]


Para confirmar si NCAPG indujo la proliferación de células NSCLC y la metástasis a través de LGALS1, Western blot se realizó para demostrar que la inhibición NCAPG reprimió notablemente los niveles de proteínas LGALS1 y SPARC, mientras que la subregulación de SPARC fue revertida en células de sobreexpresión LGALS1 (Fig. MTT, citometría de flujo y análisis de transwell se utilizaron para detectar la proliferación, migración e invasión de células H1299 y A549 con reducción NCAPG y/o LGALS1 sobreexpresión forzada (Fig. 6B-K). Estos datos mostraban las funciones de proliferación, migración e invasión en células NSCLC podría depender parcialmente del eje NCAPG/LGALS1/SPARC.


Fig. 6 La proliferación y metástasis de las células NSCLC dependían del eje NCAPG/LGALS1/SPARC. Se realizó una mancha occidental en las células A549 y H1299 con derribo NCAPG y/o superexpresión LGALS1. Se utilizó el análisis C CCK8 para detectar la proliferación de células A549 y H1299. D-F La proliferación de las células A549 y H1299 fue probada por el citometro de flujo. G-K Las capacidades de migración e invasión se midieron mediante el análisis de transwell con NCAPG knockdown y/o LGALS1 sobreexpresión. Barra de escala 50 μm. (** p seleccionada 0.01, título iere 0.001)


References:

https://theyellowdogproject.com/the-biggest-calves-in-the-world-and-the-best-in-bodybuilding/

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Ncapg Promueve La Oncogenesis Y La Progresión De La No

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